摘要: 目的：采用两样本孟德尔随机化(mr)方法研究731种免疫细胞表型与散发型克雅氏病(sporadic creutzfeld-jacob disease, scjd)发病风险的因果效应。方法：在全基因组关联研究数据库(genome wide association study, gwas)中筛选符合条件的731种免疫细胞表型及散发型克雅氏病的因果关系。共纳入了四种类型的免疫特征(mfi, rc, ac和mp)。综合敏感性分析用于验证结果的异质性和水平多向性。结果：ivw结果显示免疫细胞与免疫细胞发病风险存在因果效应，其中四种免疫表型对散发型克雅氏病的保护作用：cd24 cd27 %lymphocyte (or = 0.925, 95% ci: 0.863~0.991, p = 0.027)、cx3cr1 on monocyte (or = 0.924, 95% ci: 0.859~0.994, p = 0.034)、ssc-a on myeloid dc (or = 0.857, 95% ci: 0.740~0.993, p = 0.040)、unsw mem ac (or = 0.844, 95% ci: 0.718~0.992, p = 0.040)。六种免疫表型对散发型克雅氏病的危害作用：cd28− cd8dim %t cell (or = 1.099, 95% ci: 1.012~1.195, p = 0.025)、cd40 on cd14− cd16 monocyte (or = 1.062, 95% ci: 1.000~1.129, p = 0.050)、cd62l− myeloid dc � (or = 1.092, 95% ci: 1.009~1.183, p = 0.013)、mo mdsc ac (or = 1.123, 95% ci: 1.036~1.217, p = 0.005)、ssc-a on cd4 (or = 1.147, 95% ci: 1.035~1.271, p = 0.028)、ssc-a on nk (or = 1.116, 95% ci: 1.010~1.232, p = 0.031)。结论：我们的研究通过基因手段证明了免疫细胞与散发型克雅氏病之间的密切联系，从而为今后的临床研究与预防提供了指导。
abstract: objective: this paper aims to investigate the causal effects of 731 immune cell phenotypes and the risk of sporadic creutzfeld-jacob disease (scjd) using a two-sample mendelian randomization (mr) approach. methods: eligible 731 immune cell phenotypes were screened for causal association with sporadic creutzfeldt-jakob disease (scjd) in the genome wide association study (gwas) database. a total of four types of immune profiles (mfi, rc, ac and mp) were included. integrated sensitivity analysis was used to validate the heterogeneity and horizontal multidirectionality of the results. results: ivw results showed a causal effect of immune cells and risk of immune cell pathogenesis, with four immune phenotypes protective against disseminated creutzfeldt-jakob disease: cd24 cd27 %lymphocyte (or = 0.925, 95% ci: 0.863~0.991, p = 0.027), cx3cr1 on monocyte (or = 0.924, 95% ci: 0.859~0.994, p = 0.034), ssc-a on myeloid dc (or = 0.857, 95% ci: 0.740~0.993, p = 0.040), unsw mem ac (or = 0.844, 95% ci: 0.718~0.992, p = 0.040). the hazardous effects of six immunophenotypes on disseminated creutzfeldt-jakob disease: cd28− cd8dim %t cell (or = 1.099, 95% ci: 1.012~1.195, p = 0.025), cd40 on cd14− cd16 monocyte (or = 1.062, 95% ci: 1.000~1.129, p = 0.050), cd62l− myeloid dc � (or = 1.092, 95% ci: 1.009~1.183, p = 0.013), mo mdsc ac (or = 1.123, 95% ci: 1.036~1.217, p = 0.005), ssc-a on cd4 (or = 1.147, 95% ci: 1.035~1.271, p = 0.028), ssc-a on nk (or = 1.116, 95% ci: 1.010~1.232, p = 0.031). conclusion: our study demonstrated a close association between immune cells and disseminated creutzfeldt-jakob disease by genetic means, thus providing guidance for future clinical research and prevention.
1. 引言
免疫细胞与散发型克雅氏病(sporadic creutzfeldt-jakob disease, scjd)之间的因果联系已成为当今医学研究的焦点之一。免疫细胞作为机体防御病原体和维持内稳态的核心要素，其功能状态对个体健康至关重要。近年来，免疫细胞的工程化治疗逐步在临床应用中得到实施，并取得了显著的成果[1]。多种工程化t细胞疗法已获批准用于治疗多种疾病，同时，针对癌症和传染病领域，关于改造免疫细胞命运与功能的多种策略也在临床前和临床试验中进行评估[2]。同时，scjd以其独特的传染性和公共卫生风险引起了广泛关注。散发型克雅氏病的致死率接近100%，长期住院、昂贵的诊断和护理费用，对患者家庭和社会带来了巨大的健康和经济负担[3]。因此，深入探究免疫细胞与散发型克雅氏病的因果关系，不仅有助于精确制定治疗和预防策略，还在临床应用和公共卫生领域具有深远的意义。
2. 背景
2.1. 免疫细胞的复杂性与多样性
免疫细胞展示出显著的复杂性和多样性，包括不同类型的t细胞、b细胞、nk细胞、巨噬细胞等。这种复杂性不仅体现在细胞的表面标志和功能特性上，还表现在它们在不同生理和病理条件下的动态变化。最近有研究研究表明[4]，肿瘤微环境中的细胞表面标志物对于癌症治疗具有重要意义，不同的标志物与细胞的状态和功能高度相关。这些标志物不仅参与了细胞间的信号传导，还在免疫逃逸和炎症反应中扮演重要角色。细胞的功能特性不仅依赖于其表面标志物，还与其所在微环境中的信号传导路径和代谢状态高度相关。例如，肿瘤微环境中的细胞通过改变代谢途径适应不同的氧气浓度或营养供给，展示出不同的功能特性。此外，免疫细胞在炎症反应和组织修复中也展示了高度的功能多样性和可塑性，这种复杂性使其在不同病理条件下表现出不同的免疫反应或抑制机制。单细胞rna测序等技术的发展使得科学家能够精确揭示免疫细胞的亚群结构和功能差异，这为理解免疫系统的动态响应机制提供了新视角[5]。遗传与环境因素共同调控了免疫细胞的功能。在炎症、癌症和自体免疫等疾病中，在不同的病理状态下，免疫细胞的代谢、表观遗传调控和转录调控显著不同，导致其功能发生变化。例如，在肿瘤环境中，免疫细胞的功能会被肿瘤微环境中的代谢产物所抑制，导致免疫逃逸[6]。
2.2. 散发型克雅氏病的流行病学特征及可能引发的社会问题
散发型克雅氏病(scjd)不仅是一种严重的医学问题，其复杂的流行病学和临床特征还可能引发多重社会问题[7]。scjd是一种罕见的、快速进展的致命疾病，诊断难度大，且缺乏有效的治疗手段，这对公共卫生系统构成重大挑战。特别是在农村或医疗资源匮乏的地区，scjd患者的早期诊断和管理困难，可能会导致疾病传播和误诊的风险上升。scjd的高致死率和快速进展会给医疗系统带来极大的资源需求。长期住院、特殊诊断手段和临终关怀等服务的需求都会增加对医疗系统的负担。由于scjd的罕见性及其传染特性，患者及其家属可能会面临社会歧视和误解，给他们带来巨大的心理压力。此外，公众对scjd的了解不足，可能加剧这些问题，影响患者家庭的社会支持和心理健康。由于scjd发病率低，公共政策和社会保障措施可能相对薄弱，患者及其家属在疾病的过程中常常面临经济困难和社会支持的缺乏。
2.3. 孟德尔随机化的研究方法
我们采用孟德尔随机化(mr)方法，将免疫细胞特征作为因变量，散发型克雅氏病风险作为自变量，以遗传变异作为工具变量，研究免疫细胞与散发型克雅氏病之间的因果关系。孟德尔随机化是一种基于遗传信息的流行病学研究设计，可减少混杂因素和反向因果关系的影响。我们根据公开的遗传数据分析了731个免疫细胞特征与散发型克雅氏病风险之间的因果关系。
3. 研究资料与方法
3.1. 研究设计
本研究采用了双样本单向mendelian randomization (mr)方法，以探究免疫细胞表型与散发型克雅氏病之间的因果关系。进行了一项双样本mr研究，用以评估免疫细胞表型和散发型克雅氏病之间的因果联系。
3.2. 数据来源
免疫细胞数据来自gwas，撒丁岛的3757名个体的基因组数据和731种免疫细胞特征数据，采用流式细胞术(flow cytometry)测量731种免疫细胞表型，包括四种免疫特征(mfi、rc、ac和mp)，使用了两个不同的流式细胞仪(flow cytometers)来检测细胞的比例(proportions)、绝对数(absolute counts)和荧光强度(median fluorescence intensities, mfis)。细胞的比例是指细胞在总细胞数中所占的百分比，细胞的绝对数是指细胞在每微升血液中的数量，细胞的荧光强度是指细胞表面抗原的表达水平。这些细胞特征反映了免疫细胞的组成(composition)、数量(quantity)和功能(function) [8]。
散发型克雅氏病(scjd)研究使用了通过国家克雅氏病(cjd)转诊中心在1990年至2014年间收集的来自多个国家/地区的5208名被诊断为可能或确诊的散发型克雅氏病(scjd)患者的样本。使用illumina omniexpress阵列对4110例病例进行了基因分型，并在发现阶段使用了这些数据。另外1098例病例在复制阶段使用小沟结合探针进行了基因分型。501例cjd病例还使用illumina hiseq2000平台进行了外显子测序。散发型克雅氏病(scjd)是最常见的cjd类型，约占85%的病例。散发性克雅氏症的确切病因尚不清楚，但有人认为是一种正常的脑蛋白发生了异常变化(“错误折叠”)，变成了朊病毒。散发性cjd大多发生在45至75岁的成年人身上。平均而言，患者在60~65岁时出现症状。这项研究为深入理解散发型克雅氏病提供了详实而综合的基因组数据分析[9]。通过gwascatalog (ebi.ac.uk)网站分别获得免疫细胞和散发型克雅氏病的数据，鉴于本研究基于已公开发表的全基因组关联研究(gwas)数据，故无需进行伦理审批或取得知情同意。
3.3. 工具变量的选取
在免疫细胞的gwas中，为了保证snp与暴露因素强相关以满足第一个mr假设，我们筛选出显著性水平p < 5 × 10−8的工具变量。在全基因组水平上，我们选择了与暴露因素显著相关的snp。为了避免因snp数量过少而导致的不准确性，我们将免疫细胞表型与散发型克雅氏病的显著性阈值放宽至5 × 10−6，为了确保工具变量的独立性，我们采用了ld clumping方法，对选中的snps进行连锁不平衡(linkage disequilibrium, ld)修正，ld阈值设置为r2 < 0.001，窗口大小为10,000 kb。此步骤确保每个工具变量能够独立地代表暴露特征，而不会受到其他snps的干扰[10]。
此外，为了减少弱工具变量可能带来的偏倚，我们计算了每个工具变量的f统计量，并剔除了f值低于10的snps，以确保工具变量的强度足以支持稳健的因果推断。
所有筛选出的snps均在公开的gwas数据库中进行检索和验证，确保它们在目标人群中具有稳定的效应量和频率分布。针对每个工具变量的效应等位基因及其效应方向，我们在暴露和结局(outcome)数据集中进行了统一的编码和对齐，以防止潜在的混淆或反向因果关系影响分析结果。
最终，纳入分析的工具变量能够合理地代表暴露特征，并且符合mr分析的核心假设，为因果推断提供了稳健的基础。
3.4. 两样本孟德尔随机化的基本假设
本文以免疫细胞(immune cells)作为暴露因素，与免疫细胞显著相关的snps作为ivs，结局因素为散发型克雅氏病(sporadic creutzfeld-jacob disease, scjd)，将免疫细胞的全基因组数据(gcst0001391-gcst0002121)，共731种免疫细胞特征，进行筛选，与结局数据进行mr分析的方法进行因果分析，并进行异质性检验和多效性检验，最后对结果的可靠性进行检验。在进行mr研究时，工具变量(ivs)需要符合三个核心假设：1) 相关性假设：ivs与暴露因子显著相关，且这种相关性是独立的；2) 独立性假设：ivs与任何混杂因素无关，只通过暴露因子影响结局；3) 排他性假设：ivs对结局的影响完全通过暴露因子实现，未存在直接效应[11]。
3.5. 研究与探讨
本研究探讨免疫细胞与散发型克雅氏病发生风险的遗传相关性与因果关联，分析框架图见图1遗传相关分析包括连锁不平衡得分回归分析和基因组结构方程建模，因果关联分析包括单变量mr分析和变量mr分析。
figure 1. major overview of the study design and assumptions of the mendelian randomisation design
图1. 研究设计概述和孟德尔随机化设计的假设">">
4. 统计分析
本研究的统计分析过程包括工具变量的筛选、多种mendelian随机化(mr)方法的应用、异质性与多效性检验、以及敏感性分析。通过这些步骤，我们确保了因果推断的准确性和稳健性，并对暴露因素与结局之间的因果关系进行了全面评估。
在进行mr分析前，工具变量的筛选是确保分析结果可信度的关键步骤。我们首先从全基因组关联研究(gwas)中筛选出与暴露变量显著相关的单核苷酸多态性(snps)。具体而言，我们采用了p < 5 × 10−6的显著性阈值，以确保所选snps与暴露变量之间具有较强的统计关联。这一标准降低了弱相关snps作为工具变量的可能性，从而提高了因果推断的准确性。接下来，为了进一步评估这些snps作为工具变量的强度，我们计算了每个snp的f统计量。f统计量是衡量工具变量效力的重要指标，其计算公式为：
f = r2(n − k − 1)/[k(1 − r2)]
其中，n代表暴露变量的样本量，k为工具变量的数量，r2则反映了工具变量对暴露变量的解释程度。通常，当f > 10时，认为工具变量具有足够的强度，从而弱工具效应对mr分析结果的影响可以忽略[12]。在本研究中，每个snp的f值均大于10，具体范围为19.54至3159.29，这表明所选snps作为工具变量非常强大，进一步确保了因果推断的稳健性。因此，我们最终确定了10个snp作为工具变量，用以评估暴露因素对结局的潜在因果效应(描述主要结果的散点图见图2)。
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figure 2. scatter plot of immune cell phenotypes and scjd mendelian randomisation (mr) analyses
图2. 免疫细胞表型和散发型克雅氏病孟德尔随机化(mr)分析的散点图
为了推断暴露因素对结局的因果效应，我们采用了多种mr分析方法[13]，其中主要方法是逆方差加权法(ivw)。ivw方法假设所有工具变量均为有效且不存在水平多效性。在这种假设下，ivw通过对每个工具变量效应估计值进行加权平均，得出暴露对结局的总体因果效应估计值。ivw法的优势在于它能够在工具变量较多且效应方向一致的情况下，提供具有高统计效率的因果效应估计。为了应对工具变量可能存在无效或多效性的情况，我们还补充采用了加权中位数法(wm)和mr-egger回归法。加权中位数法在至少一半工具变量有效的情况下，仍能提供稳健的因果效应估计，而mr-egger回归法则允许对多效性进行调整，从而提供多效性校正后的因果效应估计。
在mr分析中，异质性与多效性的存在可能会影响因果效应的准确估计，因此有必要进行相关检验。我们使用cochran’s q统计量来检验ivw和mr-egger分析中的潜在异质性。cochran’s q统计量的p值大于0.05，表明工具变量之间不存在显著异质性[14]。
此外，我们通过mr-egger回归的截距项来检验水平多效性。mr-egger回归不仅提供了因果效应的估计，还允许通过截距项检测工具变量是否通过除暴露以外的路径影响结局。我们的检测结果得出的截距项的p值均大于0.05，这表明未检测到显著的水平多效性，这进一步支持了工具变量的有效性[15] (见图3)。
此外，为了进一步排除分析中的潜在偏倚，我们还绘制了漏斗图(见图4)。漏斗图显示因果效应的估计值分布基本对称，未观察到明显的出版偏倚或其他系统性偏倚。
本研究的所有统计分析均在r 4.3.2和r studio环境下完成，使用了“two sample mr”和“mr-presso”等r包。对于暴露变量的连续变量效应，我们用β系数和95%置信区间(ci)表示；而对于二分类结局变量，则使用比值比(or)和95% ci表示。为了确保结果的统计显著性，我们将显著性水平设定为α = 0.05。在各项检验中，未显示显著异质性或多效性偏倚，这进一步支持了因果推断的可靠性和结论的鲁棒性。
孟德尔随机化分析结果(见图5)，我们以ivw法作为主要分析方法探讨了散发型克雅氏病与免疫类型之间的因果效应，进行了双样本mr分析。我们检测到了两种免疫表型对散发型克雅氏病的保护作用：cd24 cd27 %lymphocyte (or = 0.925, 95% ci: 0.863~0.991, p = 0.027)、cx3cr1 on monocyte (or = 0.924, 95% ci: 0.859~0.994, p = 0.034)、ssc-a on myeloid dc (or = 0.857, 95% ci: 0.740~0.993, p = 0.040)、unsw mem ac (or = 0.844, 95% ci: 0.718~0.992, p = 0.040)，提示上述四种免疫表型每增加一个标准差，散发型克雅氏病的患病风险将降低7.5%、7.6%、14.3%、15.6%，结果具有统计学意义。
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figure 3. forest plot of the results of mendelian randomisation (mr) analysis of immune cell phenotypes and scjd
图3. 免疫细胞表型与散发型克雅氏病孟德尔随机化(mr)分析结果森林图
另外五种免疫表型对散发型克雅氏病的危害作用：cd28− cd8dim %t cell (or = 1.099, 95% ci: 1.012~1.195, p = 0.025)、cd40 on cd14− cd16 monocyte (or = 1.062, 95% ci: 1.000~1.129, p = 0.050)、cd62l− myeloid dc % dc (or = 1.092, 95% ci: 1.009~1.183, p = 0.013)、mo mdsc ac (or = 1.123, 95% ci: 1.036~1.217, p = 0.005)、ssc-a on cd4 (or = 1.147, 95% ci: 1.035~1.271, p = 0.028)、ssc-a on nk (or = 1.116, 95% ci: 1.010~1.232, p = 0.031)，提示上述六种免疫表型每增加一个标准差，散发型克雅氏病的患病风险将增加9.9%、6.2%、9.2%、12.3%、14.7%，11.6%。这些结果提示了这些免疫表型对散发型克雅氏病的不同影响，为深入理解免疫系统与散发型克雅氏病之间的关系提供了重要线索。
5. 讨论
克雅氏病(creutzfeldt-jakob disease, cjd)是一种罕见且致命的脑疾病，属于传染性海绵状脑病(tses)。cjd主要由一种异常的传染性蛋白质(朊蛋白或prion)引起，该蛋白质在脑内积聚，导致不可逆的神经细胞损伤。cjd的症状包括智力和记忆丧失、个性改变、失去平衡和协调能力、言语不清、视力问题和进行性运动功能丧失。根据疾病的病因，cjd可分为四种主要类型：散发型cjd、变异型cjd、家族型cjd
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figure 4. funnel plots of immune cell phenotypes and scjd mendelian randomisation (mr) analyses
图4. 免疫细胞表型和散发型克雅氏病孟德尔随机化(mr)分析的漏斗图
figure 5. funnel plots of immune cell phenotypes and scjd mendelian randomisation (mr) analyses
图5. 10种免疫细胞与散发型克雅氏病的因果关系森林图
和医源型cjd [16]。散发性克雅氏病(sporadic creutzfeld-jacob disease, scjd)是最常见的cjd类型，约占高达85%的病例。scjd的确切病因尚不清楚，但有人认为是一种正常的脑蛋白发生了异常变化(“错误折叠”)，变成了朊病毒[9]。scjd的发病机制复杂且多因素，涉及遗传、环境和免疫因素[17]。先前的研究表明，免疫细胞参与调节大脑中的炎症和免疫反应[18]，这可能影响scjd中的prpsc蛋白沉积、神经元损伤和星形胶质细胞增生。
我们的研究采用了详尽的孟德尔随机化分析来探索731种免疫细胞表型与散发型克雅氏病(scjd)风险之间的潜在因果关系。我们的分析表明，其中四种免疫细胞特征似乎可以预防scjd，而六种免疫细胞特征与风险增加有关。所涉及的免疫细胞特征涵盖了广泛的t细胞、b细胞、单核细胞、髓细胞和树突状细胞，强调了免疫系统在scjd发病机制中的多方面和复杂作用。我们的数据表明，免疫反应的两个组成部分，即先天免疫和适应性免疫，在scjd的病因中都发挥着重要作用。此外，不同的免疫细胞亚群在调节大脑内的炎症和免疫方面可能具有独特甚至相反的作用。
针对scjd的保护性免疫细胞特征包括 cd24 cd27 %lymphocyte、cx3cr1 on monocyte、ssc-a on myeloid dc、unsw mem ac。这些特征可能通过各种机制减轻scjd风险，可能包括抑制炎症、增强 prpsc清除、刺激神经发生。例如，cd24 cd27 淋巴细胞属于调节性b细胞(bregs)的一种，其具有优异的抗炎和免疫调节功能，它们通过分泌il-10、il-35和tgf-β等抑制性细胞因子来抑制炎症反应[19]。cd24通过与siglec-10结合，可以抑制巨噬细胞的吞噬功能，起到免疫调节作用[20]。此外，cx3cl1/cx3cr1轴在神经炎症和神经退行性疾病中的作用日益受到重视。该轴通过调节小胶质细胞的活动，在多种神经系统疾病(如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病)中发挥保护作用[21]。cx3cl1通过其受体cx3cr1调节中枢神经系统内的炎症反应，在scjd的进展中很可能对神经元起到神经保护作用。
我们的分析通过孟德尔随机化分析确定了特定的免疫细胞亚群，包括cd28− cd8dim %t cell、cd40 on cd14− cd16 monocyte、cd62l− myeloid dc �、mo mdsc ac、ssc-a on cd4 、ssc-a on nk、是散发型克雅氏病的潜在风险因素。这些免疫细胞亚群可能在神经炎症和神经元损伤中发挥关键作用，而这两者都与scjd的发病机制密切相关[22]-[24]。
我们的研究有一些局限性需要考虑。首先，我们采用了基于大型gwas队列公开可用的汇总统计数据的双样本mr方法。因此，我们无法按性别、年龄或其他可能改变免疫细胞特征与scjd风险之间关联的因素进行分层分析。其次，我们使用欧洲血统人群作为暴露和结果gwas的参考小组。因此，我们的结果可能不适用于其他族裔或具有不同遗传背景的人群。第三，我们使用相对宽松的阈值来选择每种免疫细胞特征的工具变量，以增加统计能力并避免弱工具偏差。然而，这也可能增加假阳性或水平多效性的可能性。第四，我们无法解释不同免疫细胞特征之间或可能影响scjd免疫系统的其他因素之间的潜在相互作用或协同作用。因此，我们的结果应谨慎解读，并通过进一步研究进行验证。
我们提出了一些未来研究的方向和启示。未来的研究应包括更多免疫细胞类型、更大、更多样化的群体、更多生物标志物和功能实验，以阐明免疫系统和scjd的因果机制。我们的研究结果为通过调节免疫系统来预防和治疗scjd提供了宝贵的见解。
notes
*通讯作者。