金边龙舌兰总皂苷的提取工艺及体外抗氧化研究-凯发娱乐官网

1. 前言

金边龙舌兰，具有润肺止咳、清热解毒的功能，被广泛应用于食品、药品等行业，具有较好的开发前景。金边龙舌兰中具有多种化学成分，从该植物中已经分离得到黄酮类、甾体皂苷、多糖和生物碱等，具有明显的抗炎[1]、抗菌[2]、止血[3]、抗衰老和降血糖的活性_。随着对金边龙舌兰的药理作用的广泛研究，发现金边龙舌兰总皂苷具有抑制病原菌生长繁殖、抑制肿瘤细胞增殖以及免疫调节等药理活性，目前呼吸道疾病的治疗方法主要基于化学药物，然而，长期使用化学药物会导致诸多副作用，例如身体免疫力下降等[4]。因此，寻找新型、卓效、无毒的天然药物具有重要意义，金边龙舌兰总皂苷具有良好的治疗呼吸道疾病的作用，可为开发哮喘以及咳嗽等天然药物提供新的研究思路。

目前对皂苷研究较彻底的还是三七[5]、人参[6]、天冬[7]等皂苷，对龙舌兰总皂苷的研究较少，而对龙舌兰总皂苷的提取研究还未见报道[8]。本文对金边龙舌兰总皂苷的提取工艺进行优化，以金边龙舌兰总皂苷的提取率作为参考标准，分别考察提取试剂、料液比、超声时间、超声温度对金边龙舌兰总皂苷提取率的影响[9]，应用正交试验法优化其提取工艺，给金边龙舌兰总皂苷提取的工业化生产及其资源开发提供参考。

2. 材料与方法

2.1. 材料

金边龙舌兰叶片，薯蓣皂苷元标准品(hplc ≥ 95%，20 mg，品牌：acmec)，2,2-联苯基-1-苦基肼基标准品(hplc ≥ 95%，100 mg，品牌：罗恩)高氯酸，无水乙醇，甲醇，水杨酸，硫酸亚铁，l-抗坏血酸，30%过氧化氢，去离子水；所用试剂均为分析纯。

2.2. 仪器

cary 100scan紫外分光光度计，电热恒温鼓风干燥箱，旋转蒸发仪(型号：osb-2200)，shz-dⅲ予华牌循环水真空泵，hz602b电子天平。

2.3. 方法

2.3.1. 对照品溶液的制备

选取并称量薯蓣皂苷元标准品7 mg，将其放置于干燥的50 ml容量瓶中，量取20 ml甲醇溶液使其溶解[10]，再加入甲醇稀释至容量瓶刻度线处，将其混合均匀后得到0.28 mg/ml的对照品溶液。

2.3.2. 供试品的制备

将金边龙舌兰叶片切碎，并将其放置于在烘箱中烘干2 h，取出后用粉碎机粉碎，最终通过40目筛进行细磨[11]，得金边龙舌兰粗粉，装入洁净干燥的密封袋中后备用。

2.3.3. 薯蓣皂苷元标准曲线的制备

用移液枪分别吸取薯蓣皂苷元标准溶液0.08 ml，0.12 ml，0.16 ml，0.20 ml，0.24 ml，并将溶液均匀置于洁净试管中，于80℃环境下烘干；烘干后取出，将试管室温放置10 min，使其放冷。接着移取5 ml高氯酸于试管中，充分混匀后至于70℃水浴15 min充分显色[12]。将试管室温放置15 min，使其降温。使用紫外分光光度计(cary 100scan)于既定波长为407 nm处分别测定吸光度数值大小，记录所测得吸光度数值。通过将薯蓣皂苷元的质量浓度与其吸收率作比较，得到薯蓣皂苷元标准曲线方程为：y = 12.6741x − 0.0228 (r² = 0.9972)。

由表1和图1可知，薯蓣皂苷元浓度在0.004~0.27 mg/ml这一区间内与吸光度呈线性关系，因此可以应用此曲线方程完成对金边龙舌兰总皂苷提取工艺的研究[13]。

table 1. effect of diosgenin solution concentration on absorbance

表1. 薯蓣皂苷元溶液浓度对吸光度的影响

figure 1. relationship between concentration and absorbance of geniposide solution

图1. 蓣皂苷元溶液浓度与吸光度的关系

2.3.4. 金边龙舌兰总皂苷含量的测定

经过单一因子实验，获得金边龙舌兰总皂苷样本，将其放置于干燥的50 ml容量瓶中，量取一定量甲醇溶液使其溶解，再加入甲醇稀释至容量瓶刻度线处[14]，移取0.16 ml置于试管中，80℃烘箱中烘干；取出冷却10 min，再加入5 ml的高氯酸，在70℃水浴下显色15 min，充分冷却后使用紫外–可见分光光度计在407 nm波长处测定吸光度值。提取率计算公式[15]：

总皂苷提取率/% = (c × v)/m × 100

式中：c表示总皂苷粗品的质量浓度，单位为mg/ml；v表示总皂苷粗品的定容体积，单位为ml；m表示称取的金边龙舌兰粉末质量，单位为mg。

2.3.5. 单因素对照实验

1) 提取试剂乙醇浓度

将金边龙舌兰粗粉分为五份，每份2 g，分别放置于锥形瓶内，并向其中加入30 ml乙醇溶液，其比例分别是50%、60%、70%、80%、90%的乙醇，在60℃温度下超声40 min，取出冷却至室温，抽滤得到滤液[16]。取0.16 ml样品液，并采用1.3.4法进行吸光度检验，最终得出总皂苷提取率，详见表2。(因由吸光度计算得到的提取率差距不明显，所以其提取率值均保留到小数点后三位)。

table 2. effect of extraction reagent ethanol concentration on extraction rate

表2. 提取试剂乙醇浓度对提取率的影响

2) 料液比

将金边龙舌兰粗粉分为五份，每份2 g，分别放置于锥形瓶中，向其中添加浓度为70%的乙醇溶液40 ml，按照1:10、1:15、1:20、1:25、1:30的料液比，在60℃温度下超声40 min，取出冷却至室温，抽滤得到滤液。取0.16 ml样品液，并采用1.3.4方法进行吸光度检验，最终得出总皂苷提取率，详见表3。

table 3. effect of solid-liquid ratio on extraction rate

表3. 料液比对提取率的影响

table 4. effect of ultrasonic time on extraction rate

表4. 超声时间对提取率的影响

3) 超声时间

将金边龙舌兰粗粉分为五份，每份2 g，分别放置于锥形瓶中，向其中添加浓度为70%的乙醇溶液40 ml，调节温度为60℃，超声时间依次为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，在室温下抽滤得到滤液。取0.16 ml样品液，并采用1.3.4方法进行吸光度检验，最终得出总皂苷提取率，详见表4。

4) 超声温度

将金边龙舌兰粗粉分为五份，每份2 g，分别放置于锥形瓶中，向其中添加浓度为70%的乙醇溶液40 ml，将温度分别调节至50℃、60℃、70℃、80℃、90℃，进行50 min超声处理，在室温下抽滤得到滤液。取0.16 ml样品液，并采用1.3.4方法进行吸光度检验，最终得出总皂苷提取率，详见表5。

table 5. effect of ultrasonic temperature on extraction rate

表5. 超声温度对提取率的影响

3. 结果与分析

以金边龙舌兰总皂苷的提取率作为参考标准，分别考察前述四个因素对金边龙舌兰总皂苷提取率的影响。

3.1. 提取试剂乙醇浓度对提取率的影响

根据图2，当乙醇浓度介于50%至60%时，总皂苷提取率呈现出平缓上升状态，当乙醇浓度在60%至70%时，总皂苷提取率呈现明显上升趋势，乙醇浓度在70%至90%时，总皂苷提取率呈现下降趋势。可能是由于随着浓度的增加有利于总皂苷的提取，但当浓度超过一定限度后，造成杂质的溶出相应增多，从而降低了总皂苷的相对含量[17]。因此，在乙醇浓度为70%时，总皂苷提取率最高，为9.680%。

figure 2. relationship between extraction reagent ethanol concentration and extraction rate

图2. 提取试剂乙醇浓度与提取率的关系

3.2. 料液比对提取率的影响

根据图3，从图中可以看出，料液比在1:10与1:20之间时，总皂苷提取率处于上升状态，并且在料液比为1:20时，提取率达到最大值；当料液比大于1:20后，随着液体的增加，总皂苷的提取率呈下降趋势。在料液比为1:20时，总皂苷的提取率为7.79%。

figure 3. relationship between solid-liquid ratio and extraction rate

图3. 料液比与提取率的关系

3.3. 超声时间对提取率的影响

figure 4. relationship between ultrasonic time and extraction rate

图4. 超声时间与提取率的关系

根据图4，提取时间介于20 min至40 min之间时，总皂苷提取率呈现平缓上升状态，超声时间在40 min至50 min之间，总皂苷提取率呈现上升的趋势，提取时间在50 min至60 min之间，总皂苷提取率呈现下降状态。这可能是因为，随着提取时间的延长，溶液中的可溶性成分渐渐增多，总皂苷的提取率升高；但提取时间过长，也可能会溶出其它物质，使得总皂苷的提取率降低[18]。所以在提取时间为50 min时，总皂苷提取率最高为7.785%。

3.4. 超声温度对提取率的影响

根据图5，超声温度在50℃至60℃之间时，总皂苷提取率处于平缓上升状态，超声温度在60℃至80℃之间时，总皂苷提取率处于上升状态，超声温度在80℃至90℃之间时，总皂苷提取率处于下降的状态。这可能是因为，温度过高破坏了总皂苷的结构，同时也使更多杂质溶出，降低了金边龙舌兰总皂苷的提取率。所以在超声温度为80℃时，总皂苷提取率最高为8.092%。

figure 5. relationship between ultrasonic temperature and extraction rate

图5. 超声温度与提取率的关系

3.5. 正交实验

3.5.1. 正交实验对金边龙舌兰总皂苷提取条件的优化

利用超声辅助提取的方法，在每个影响因素中，根据单因素实验所得最优提取条件，分别选取三个水平作为自变量，总皂苷的提取率为因变量，设计四因素三水平的正交试验优化金边龙舌兰总皂苷的提取。实验因素和水平编码见表6。

table 6. four factors and three levels

表6. 四因素三水平表

3.5.2. 正交试验结果分析

根据单因素试验结果，在选定了多个直接影响提取效果的重要实验因素(包括乙醇浓度、料液比、提取时间、提取温度)的基础上，每个因素选取3个水平，按l₉(3⁴)正交表对回流提取工艺进行试验研究[19]，以总皂苷的含量为指标，选取最佳工艺[17]。利用spssau软件设计试验方案，结果如表7所示。

table 7. orthogonal experiment design table

表7. 正交试验设计表

根据因素水平表进行正交试验，试验结果如表8所示。

table 8. orthogonal test results

表8. 正交试验结果

提取试剂乙醇浓度、料液比、超声时间、超声温度均对金边龙舌兰总皂苷的含量提取有显著影响，程度依次为b > d > a > c，即料液比 > 超声温度 > 提取试剂乙醇浓度 > 超声时间。通过极差分析得到的理论最优组合为a3b3c2d2 [20]。

3.6. 最佳提取工艺的验证

通过实验验证，金边龙舌兰总皂苷的最佳提取工艺为：乙醇浓度60%、料液比1:25 (g:ml)、超声时间60 min、超声温度80℃。以最佳提取条件进行3次平行试验，得到金边龙舌兰总皂苷提取率为10.213%。说明该提取条件具有较好的合理性和可靠性，能够有效优化金边龙舌兰总皂苷的提取工艺。

3.7. 体外抗氧化活性研究的分析

3.7.1. dpph自由基的清除能力

根据图6所示，金边龙舌兰总皂苷对dpph自由基有较强的清除效果。随着金边龙舌兰总皂苷浓度的增加，对dpph自由基的清除率也相应的增加。在浓度为0.011~0.056 mg/ml范围内，金边龙舌兰总皂苷的抗氧化活性要明显高于与阳性对照组l-抗坏血酸[21]。当浓度为0.056 mg/ml时，其dpph清除率达到最高值81.220%。

figure 6. scavenging effect of agave americana var. marginata total saponins on dpph free radicals

图6. 金边龙舌兰总皂苷对dpph自由基的清除效果

figure 7. scavenging effect of agave americana var. marginata total saponins on hydroxyl radicals

图7. 金边龙舌兰总皂苷对羟基自由基的清除效果

3.7.2. 羟基自由基的清除能力

根据图7所示，金边龙舌兰总皂苷对羟基自由基有一定的清除能力。当金边龙舌兰总皂苷含量升高时，其清除羟基自由基的效果也会随之提升[22]。在金边龙舌兰总皂苷浓度为0.011~0.056 mg/ml范围内，其具有较强的抗氧化作用，且效果优于阳性对照组l-抗坏血酸[23]。当浓度为0.056 mg/ml时，其羟基清除率达到最高值75.080%。

4. 结论

本研究通过正交试验对金边龙舌兰总皂苷的提取工艺进行优化，在单因素实验基础上，得到最佳提取工艺为：提取试剂乙醇浓度为60%、料液比为1:25 (g:ml)、超声时间为60 min、超声温度为80℃，金边龙舌兰总皂苷的提取率为10.213%；此外，通过体外抗氧化研究，对金边龙舌兰总皂苷的dpph自由基清除率和羟基自由基清除率进行测定，均有较好的清除率，具有较好的抗氧化性能。本研究较为系统全面地优化金边龙舌兰中总皂苷的提取工艺，为金边龙舌兰总皂苷的开发利用奠定基础。

基金项目

国家级大学生创新创业训练计划项目(202310377032)，安徽省大学生创新创业训练计划项目(202310377032)。

notes

^*通讯作者。

参考文献