1. 引言
姜黄为姜科姜黄属多年生草本植物，可药食两用。具有通经止痛、行气破血等功效[1]。临床上常用于祛风疗痹、抗肿瘤[2] [3]、抗氧化、保肝、抗衰老等[4]-[6]。姜黄的有效成分主要有总姜黄素(姜黄素类化合物)、挥发油及多糖等[7]-[9]。姜黄挥发油成分主要有姜黄烯、倍半萜烯醇、姜黄酮、黄酮等[10] [11]，有特殊香味，具有很好的抗氧化、抗菌、抗肿瘤等作用[12] [13]。有关挥发油的提取方法较多，主要有水蒸气蒸馏法、溶剂提取法、酶辅助法、超声波辅助法、超临界流体萃取法等[14]-[16]。不同提取方法对姜黄挥发油的提取率和成分分布都有一定的影响，会较大程度地影响姜黄挥发油品质的评价[17]。张玲玲等人采用同时蒸馏萃取法，选择石油醚、正己烷、乙醚3种萃取剂及纤维素酶、盐析辅助共五种方式提取姜黄挥发油，并利用gc-ms鉴定姜黄挥发油的化学成分。结果显示，提取效果和成分差异均较大，且提取率均小于3.6% [18]。本文着重对姜黄挥发油的提取工艺进行优化以提高其提取率，并测试分析和定量比较姜黄挥发油对dpph自由基的抗氧化活性，为姜黄产品的深入开发和应用提供参考。
2. 实验部分
2.1. 仪器与材料
uv-2600型紫外–可见分光光度计(日本岛津)、ax224zh型电子天平(奥豪斯)、hh-s6电热恒温水浴锅(北京科伟永兴)、高速万能粉碎机(北京科伟永兴)、gfx-01智能型电热恒温鼓风干燥箱(上海琅玕)、df-101s集热式恒温加热磁力搅拌器(郑州长城科工贸)。
1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(dpph，色谱纯，上海思域化工科技)、无水乙醇(分析纯，天津市河东区红岩试剂)，实验用水为蒸馏水。姜黄药材购自药材批发市场，经西安医学院生药教研室张寒教授鉴定。
2.2. 实验方法
2.2.1. 水蒸气蒸馏法提取挥发油
称取一定目数的干燥姜黄粉末10 g置于250 ml圆底烧瓶中，加入不同体积的蒸馏水，连接挥发油提取器与回流冷凝管，电热套缓慢加热至沸腾，保持一定时间至挥发油测定器油量一定，停止加热，放置，读数，记录挥发油提取量v ml。
2.2.2. 姜黄挥发油密度的测定
精密吸取最优条件下提取的姜黄挥发油v ml，置于质量为m g的10 ml洁净离心管中，精密称量质量为m g。根据公式ρ = (m − m)/v计算姜黄挥发油的密度。
2.2.3. dpph溶液的配制
准确称取dpph 0.0644 g，用95%乙醇溶解至250 ml容量瓶中，定容，摇匀，得浓度为257.70 mg/l的dpph溶液标准储备液(6.5 × 10−4 mol/l)；吸取标准液8.00 ml至100 ml容量瓶中，定容，摇匀，得浓度为20.62 mg/l的dpph溶液，避光。
2.2.4. 姜黄挥发油溶液的配制
精密吸取姜黄挥发油1.00 ml于10 ml容量瓶，用95%乙醇稀释至刻度线，摇匀，作为储备液，并逐级稀释成浓度梯度的姜黄挥发油溶液。
2.2.5. 清除dpph自由基的测定方法
分别以95%乙醇溶液作参比，在dpph的λmax下测定以下三种稳定体系的吸光度：① dpph 蒸馏水、② dpph 提取液、③ 提取液 乙醇分别记为a0、a1、a2；用公式y = [a0 − (a1 − a2)]/a0 × 100%计算不同姜黄挥发油的清除率(y)。以清除率对姜黄挥发油溶液的浓度(x)进行线性拟合，计算不同挥发油提取液的ic50值，进而定量比较不同批次姜黄挥发油的抗氧化活性。
3. 结果与讨论
3.1. 姜黄挥发油提取正交试验
通过单因素试验可知，影响姜黄挥发油提取率的主要因素有料液比(a)、姜黄粉碎目数(b)和提取时间(c)，以姜黄挥发油的提取率为评价因子，设计三因素三水平的正交试验l9(33)，结果见表1和表2。
table 1. factor and level design table
表1. 因素水平设计表
|
a 料液比(g/ml) |
b 目数 |
c 时间(h) |
1 |
1:10 |
40 |
4 |
2 |
1:15 |
60 |
5 |
3 |
1:20 |
80 |
6 |
table 2. orthogonal test for extraction of turmeric volatile oil
表2. 姜黄挥发油提取正交试验
编号 |
a |
b |
c |
提取率% (ml/g) |
1 |
1 |
1 |
1 |
6.42 |
2 |
1 |
2 |
2 |
7.05 |
3 |
1 |
3 |
3 |
6.03 |
4 |
2 |
1 |
2 |
6.40 |
5 |
2 |
2 |
3 |
6.81 |
6 |
2 |
3 |
1 |
8.98 |
7 |
3 |
1 |
3 |
6.62 |
8 |
3 |
2 |
1 |
9.36 |
9 |
3 |
3 |
2 |
8.04 |
k1 |
6.50 |
6.48 |
8.25 |
|
k2 |
7.40 |
7.74 |
7.16 |
|
k3 |
8.01 |
7.68 |
6.49 |
|
r |
1.51 |
1.26 |
1.76 |
|
由正交试验表可以看出，3个因素中对姜黄挥发油的提取率影响大小顺序是：提取时间 > 料液比 >目数，最佳提取条件为a3b2c1，即料液比1:20，粉碎目数60，提取时间4 h。
3.2. 姜黄挥发油的测定结果
取6批姜黄药材(s1~s6)，按上述最优提取方法和密度测定方法，平行提取和测定，得到姜黄挥发油密度和提取率的测定结果，分别见表3和表4。
table 3. determination results of turmeric volatile oil density
表3. 姜黄挥发油密度的测定结果
编号 |
v (ml) |
m (g) |
m (g) |
ρ (g/ml) |
s1 |
0.40 |
4.0445 |
4.2995 |
0.6375 |
s2 |
0.41 |
4.0445 |
4.3068 |
0.6398 |
s3 |
0.42 |
4.0443 |
4.3107 |
0.6343 |
s4 |
0.39 |
4.0441 |
4.3015 |
0.6600 |
s5 |
0.42 |
4.0442 |
4.3092 |
0.6309 |
s6 |
0.38 |
4.0439 |
4.2918 |
0.6524 |
table 4. determination results of the extraction rate of turmeric volatile oil
表4. 姜黄挥发油提取率的测定结果
编号 |
s1 |
s2 |
s3 |
s4 |
s5 |
s6 |
提取率% (ml/g) |
7.92 |
8.08 |
8.52 |
7.80 |
9.06 |
7.64 |
由测定结果可知，不同批次姜黄挥发油的密度和提取率均有一定差异。密度由大到小顺序为s4 > s6 > s2 > s1 > s3 > s5；提取率差异较大，s5 > s3 > s2 > s1 > s4 > s6，但均大于7.0% (ml/g)，符合药典规定[1]，且高于张玲玲等人采用5种不同提取方法的最高提取率3.6% [18]。同时发现，姜黄挥发油密度和其提取率之间没有太大关系。
3.3. 姜黄挥发油与dpph溶液体系的稳定性
在一定量dpph溶液中加入抗氧化剂姜黄挥发油溶液，在520 nm测定反应体系的吸光度a随时间的变化曲线(见图1)。由图可知，加入姜黄挥发油溶液后，体系的吸光度在25 min内下降较快，在25~35 min内变化趋势缓慢，40 min后基本稳定，最终确定dpph溶液与抗氧化剂姜黄挥发油的反应时间为40 min。
figure 1. change trend of absorbance of dpph solution with time after adding turmeric volatile oil
图1. 加入姜黄挥发油溶液后dpph溶液的吸光度随时间变化趋势
3.4. 不同批次姜黄挥发油的抗氧化活性分析
配制6批姜黄药材所提取的姜黄挥发油溶液，按照“2.2实验方法”对不同批次的姜黄挥发油溶液进行抗氧化测试。分别测试不同批次的姜黄挥发油对dpph的清除率，以清除率(y)对姜黄挥发油溶液的浓度(x)进行线性拟合，得到线性方程和拟合系数，见表5。比较不同批次的姜黄挥发油溶液的ic50值(即清除率为50%时的浓度，也列于表5)。研究结果表明，不同批次的姜黄挥发油溶液对dpph具有不同的抗氧化能力，其清除率在15%~70%范围内与质量浓度呈较好的线性关系。且ic50值越低，抗氧化活性越强。由此得知姜黄挥发油清除dpph自由基的能力从强到弱依次为：s4 > s6 > s1 > s3 > s2 > s5。
table 5. determination results of antioxidant activity of turmeric volatile oil
表5. 姜黄挥发油的抗氧化性测试结果
no. |
线性方程 |
回归系数r |
ic50/(mg/ml) |
s1 |
y = 0.0067x 0.1562 |
0.9982 |
51.31 |
s2 |
y = 0.0058x 0.1586 |
0.9936 |
58.86 |
s3 |
y = 0.0082x 0.0343 |
0.9895 |
56.79 |
s4 |
y = 0.0089x 0.0875 |
0.9887 |
46.35 |
s5 |
y = 0.0074x 0.0640 |
0.9839 |
58.92 |
s6 |
y = 0.0078x 0.1103 |
0.9904 |
49.96 |
4. 结论
本实验通过三因素三水平l9(33)正交试验设计，优化得到水蒸气蒸馏法提取姜黄挥发油的最佳提取工艺：料液比1:20 (g/ml)，粉碎目数60，提取时间4 h；不同批次的姜黄药材中姜黄挥发油的提取率均大于7.0% (ml/g)，符合中国药典规定。同时，采用uv-vis光谱法定量比较了6批姜黄挥发油对dpph自由基的清除能力，发现不同批次的姜黄挥发油含量和抗氧化活性存在一定差异。该工艺操作简单，提取率高，结果稳定可靠，可为姜黄挥发油的研发提供数据支持，为姜黄产品的开发应用提供参考。
基金项目
大学生创新创业训练计划项目(s202311840053, 121523053)；陕西省科技计划项目(2023-jc-yb-766, 2023-jc-qn-0629)；西安医学院科研能力提升计划项目(2022nlts073)。
notes
*通讯作者。