摘要: 目的：通过网络药理学方法研究黄柏治疗尿酸性肾病(uric acid nephropathy, uan)的分子机制。方法：借助中药系统药理学数据库与分析平台(tcmsp)和swiss target prediction获得黄柏的活性成分及对应靶点，利用genecards数据库和在线人类孟德尔遗传数据库(omim)获取uan的相关靶点。使用venn2.1.0平台得到相应药物靶点与疾病靶点的交集并将其导入string数据库以构建蛋白相互作用网络，然后将ppi网络导入cytoscape3.9.1软件构建“药物–有效成分–靶点”，筛选可能发挥治疗作用的核心靶点，将交集靶点导入metascape数据库进行基因本体(go)富集分析和京都基因和基因组百科全书(kegg)信号通路富集分析获知其潜在的作用机制，并在微生信进行可视化处理。结果：药物共筛选到20个有效成分并得到554个靶点。得到uan的靶点共1540个，其中交集靶点172个。ppi网络筛选出核心靶点33个。经go分析和kegg分析，表明黄柏可能主要通过调控多条信号通路抑制尿酸的合成、降低肾脏中炎症因子表达的作用来对uan起到治疗作用。结论：本研究运用网络药理学的分析方法预测黄柏治疗uan可能的活性成分、关键靶点及作用通路，体现中药治疗疾病具有“多成分、多靶点、多途径”的特点，为其药效物质基础和作用机制研究提供理论基础，印证临床上运用黄柏治疗uan的可行性。
abstract: objective: to investigate the molecular mechanism of phellodendron in the treatment of uric acid nephropathy (uan) by network pharmacology methods. methods: the active components and corresponding targets of phellodendron were obtained from the traditional chinese medicine system pharmacology database and analysis platform (tcmsp) and swiss target prediction. the targets of uan were obtained from the genecards database and the online mendelian inheritance in man (omim) database. the intersection of drug targets and disease targets was obtained using the venn2.0.1 platform and imported into the string database to construct a protein-protein interaction network, which was then imported into cytoscape3.9.1 software to construct a “drug-active component-target” network. the core targets were screened, and the intersection targets were imported into metascape database for gene ontology (go) enrichment analysis and kyoto encyclopedia of genes and genomes (kegg) pathway enrichment analysis to reveal their potential mechanisms of action, which were then visualized in microhis. results: a total of 20 effective components were identified, and 554 targets were obtained. a total of 1540 targets of uan were obtained, including 172 intersection targets. 33 core targets were selected from the ppi network. go analysis and kegg analysis showed that phellodendron may mainly regulate multiple signaling pathways to inhibit the synthesis of uric acid and reduce the expression of inflammatory factors in the kidney to treat uan. conclusion: this study uses network pharmacology analysis methods to predict the active components, key targets, and action pathways of huangbo in the treatment of uan, reflecting the characteristics of traditional chinese medicine in treating diseases, such as “multiple components, multiple targets, and multiple pathways”. it provides a theoretical basis for the study of the pharmacological effects and mechanisms of action of phellodendron, and confirms the feasibility of clinically using phellodendron to treat uan.
1. 引言
尿酸性肾病(uric acid nephropathy, uan)又称高尿酸血症肾病，是由于人体嘌呤代谢紊乱而导致血尿酸异常升高至饱和状态，导致尿酸晶体沉积于远端小管或集合管管腔，引发肾小管及间质的炎性反应，导致肾脏血流灌溉不足，从而引起肾脏损害的一组临床综合征[1] [2]。其中包括急性尿酸性肾病、慢性尿酸性肾病及尿酸性肾石症[3]。临床上多表现为水肿、蛋白尿、高血压，有肾结石者表现为腰痛、血尿或尿频、尿急、尿痛和发热[4]。近年来随着对尿酸性肾病的研究，现代医学表明中医药对尿酸性肾病的临床疗效确切，应用前景广泛。其中单味中药对治疗尿酸性肾病的研究备受关注。
黄柏味苦，性寒，主归肾、膀胱二经，具有清热燥湿、泻火解毒、除骨蒸等功效[5]。据数据统计分析，黄柏在中药复方治疗uan的支持度和选择度较高[6]。且研究发现黄柏对uan大鼠有明显的治疗作用，可以降低血尿酸，减少尿酸盐在肾脏的沉积，并且可以抑制肾组织中tnf-α、cox-2炎性因子的表达，从而减轻肾脏损害[7]。但目前对于黄柏治疗uan的有效成分和作用机制的研究尚有不足，通过网络药理学分析其有效成分、作用靶点及潜在的作用机制来探究黄柏对uan的作用机制，以期为临床和相关实验研究提供理论参考。
2. 研究方法
2.1. 黄柏有效成分及其靶点筛选
利用tcmsp数据库()，以ob ≥ 30% (口服生物利用度)和dl ≥ 0.18 (类药性)为筛选条件，检索黄柏有效成分。根据各成分的pub chem cid在pub chem数据库中进行检索，获得候选化合物的canonical smiles编号，若其无pub chem cid则在tcmsp数据库中下载其分子图片利用结构计算站()计算其smiles编号。在得到所有成分的smiles编号后将其导入到swiss adme数据库()，筛选出胃肠道吸收为“high”，类药性至少有一个“yes”的有效成分。再将筛选到的成分的smiles编号导入swiss target prediction数据库中获取黄柏候选化合物的靶点，并剔除掉未预测到靶点的化合物。最后根据靶点对应的uniprot号对靶点进行去重和规范化处理。
2.2. uan靶点筛选
利用omim数据库和genecards数据库，以“uric acid nephropathy”、为关键词进行检索，获得uan的相关靶点。并根据靶点对应的uniprot号对靶点进行去重和规范化处理。
2.3. 潜在靶点蛋白质–蛋白质互作网络的构建
利用venny2.1.0 ()对uan相关靶点与黄柏相关靶点进行交互映射，获得交集靶点，并将所得结果以venn图的形式呈现。然后将交集靶点导入string数据库，蛋白质种类设置为“homo sapiens”，其他参数值保持默认，得到黄柏治疗uan潜在靶点的蛋白质–蛋白质互作网络。随后将其导入cytoscape3.9.1并利用centiscape2.2插件计算网络的degree值、betweenness值、closeness值以获得该网络的核心靶点。
2.4. go富集分析和kegg信号通路富集分析
将交集靶点导入metascape数据库进行分析，设置物种为“homo sapiens”，p ≥ 0.01，然后依次进行“goterm_bp_direct”、“goterm_cc_direct”、“goterm_mf_direct”go富集分析和kegg信号通路富集分析，以得到黄柏作用于uan时的生物进程和关键信号通路，并将结果按照pvalue进行倒序排序，分别以柱状图和气泡图的形式呈现。
3. 结果
3.1. 中药活性成分及药物靶点的筛选结果
根据筛选条件，本研究共检索到黄柏活性成分共23个。另外，基于靶点数据库剔除掉未预测到靶点的化合物共3个，最终得到有效的活性成分共20个，通过靶点数据库得到黄柏靶点1403个，再根据uniprot号进行标准化及去重后共得到554个靶点。
3.2. uan靶点检索结果
通过gencards、omim数据库分别检索uan的靶点，其中uan在gencards数据库检索到1359个靶点、omim数据库中检索到200个靶点，将靶点合并及去重后得到1540个疾病靶点。将筛选后的黄柏药物成分靶点与uan靶点取交集，其中交集靶点172个，绘制venn图，见图1。再将数据导入cytoscape3.9.1软件，构建药物成分–交集靶点网络，其中红色信标形代表药物，绿色菱形代表黄柏的有效成分，紫色圆形代表药物作用疾病的靶点。其中节点越大，代表药物成分和靶点越重要，见图2。根据度值大小，筛选出药物中对疾病作用的重要化合物，见表1。
figure 1. venn diagram of the targets of phellodendron in the treatment of uan
图1. 黄柏治疗uan的靶点venn图
figure 2. phellodendron composition-intersection target network
图2. 黄柏成分–交集靶点网络
table 1. information table of important compounds of phellodendron
表1. 黄柏重要化合物信息表
药物成分 |
中文名称 |
ob% |
dl |
degree值 |
h1 |
黄连素 |
36.86 |
0.78 |
43 |
h17 |
槲皮素 |
46.43 |
0.28 |
43 |
h14 |
棕榈碱 |
64.6 |
0.65 |
42 |
h6 |
珊瑚菜素 |
40.19 |
0.28 |
40 |
h10 |
白屈菜红碱 |
34.18 |
0.78 |
39 |
h5 |
异槲皮素衍生物 |
35.86 |
0.44 |
38 |
h16 |
异延胡索单酚碱 |
35.77 |
0.59 |
36 |
h4 |
黄柏酮 |
43.29 |
0.77 |
33 |
h18 |
四氢小檗碱 |
53.83 |
0.77 |
32 |
h12 |
卡维丁 |
35.64 |
0.81 |
31 |
figure 3. protein interaction network of potential targets
图3. 潜在靶点的蛋白互作网络
3.3. 黄柏成分——uan靶点ppi网络构建
将黄柏和uan的交集靶点提交至string数据库得到其247个潜在靶点，并导入cytoscape3.9.1构建，结果如图3示。经cytoscape3.9.1并利用centiscape2.2插件通过计算degree值、betweenness值、closeness值进一步分析后得到黄柏治疗uan的关键靶点33个。并利用cytoscape3.7.0中的“network analyzer”插件对关键靶点的ppi网络进行分析。分析结果如图4所示，节点越大、连线越多、颜色越深表明该靶点越重要。
figure 4. ppi protein interaction network of key targets
图4. 关键靶点的ppi蛋白互作网络
3.4. 基因本体(go)富集分析和京都基因和基因组百科全书(kegg)信号通路富集分析
利用metascape数据库进行分析，得到kegg通路217条，通路富集显著表现在癌症途径、癌症中的蛋白聚糖、pi3k-akt信号通路、内分泌的阻力、脂质和动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、egfr酪氨酸激酶抑制剂耐药性、age-rage信号通路在糖尿病并发症中的作用、化学致癌–受体活化、胰腺癌等见图5。条目的前20条以气泡图呈现。
在go生物进程分析过程中关联条目共2723个，其中涉及生物过程条目共1933个，分子功能条目共193个，细胞组成条目共115个。其中生物过程涵盖了对激素的反应、积极调节细胞迁移、正调控磷代谢过程、正向调节磷酸盐代谢过程、细胞对氮化合物的反应等过程；细胞组成包括受体复合物、膜筏、膜性结构域、树突、树枝状树突等部位；分子功能包括调节磷酸转移酶活性，醇基为受体、激酶活性、蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白激酶结合等。各条目的前20位合并为三合一的柱状图呈现，见图6。
figure 5. enrichment analysis of kegg signal pathway
图5. kegg信号通路富集分析
figure 6. go gene ontology analysis three-in-one diagram
图6. go基因本体分析三合一图
4. 讨论
尿酸性肾病(uan)在祖国医学中未有对应的记载，根据临床表现，可归属于“痛风”“历节”“痹症”等范畴，其病机多为本虚标实，风寒湿邪侵袭影响脾肾等脏腑发病，多表现为脾肾功能失司，并兼有痰瘀、湿浊、热毒等实邪[8]。黄柏为清热燥湿解毒之品，长于泻肾之相火，是治疗下焦湿热所致历节痛风之要药，其与uan病机相对应。且研究表明黄柏具有降低尿酸的作用[9]。虽然黄柏在临床上广泛用于uan，但其有效成分和作用机制的研究尚有不足，本研究通过网络药理学方法，探究黄柏治疗uan的潜在机制。
采用网络药理学解析黄柏治疗uan的分子机制后，“黄柏有效成分–潜在靶点”图显示黄柏治疗uan的核心成分为黄连素、槲皮素、棕榈碱、珊瑚菜素、白屈菜红碱等。黄连素又称小檗碱，是从中药黄连中分离的一种季铵生物碱，具有抗氧化、抗炎和抗细胞凋亡的特性。研究表明黄连素可以逆转炎症因子(il-1β、il-18)和乳酸脱氢酶(ldh)的上调，并增强抗凋亡蛋白bcl-2的表达，从而减轻尿酸诱导的肾脏细胞损伤[10]。二氢小檗碱是黄连素的氢化衍生物，研究表明二氢小檗碱通过抑制高尿酸血症小鼠肾脏中的xod、urat1、glut9和nlrp3炎症小体的激活，从而达到降尿酸和肾脏保护的作用[11]。槲皮素是一种天然黄酮类化合物，具有较强的抗氧化性质，可以稳定自由基并保护细胞免受自由基损伤[12]。研究表明槲皮素可以增强abcg2、urat1、glut9表达来减轻黄嘌呤氧化酶(xod)抑制，从而抑制尿酸合成和重吸收来改善高尿酸血症肾病[13]。由此可见黄柏主要通过抑制尿酸的合成、降低肾脏中炎症因子的表达等机制来治疗uan。
通过构建和分析ppi靶点网络得到核心靶点度值排名前十的靶点为akt1、egfr、stat3、src、casp3、hif1a、pparg、mmp9、ptgs2、esr1。akt1编码人类akt丝氨酸–苏氨酸蛋白激酶家族的三个成员之一，通常称为蛋白激酶b。研究表明尿酸性肾病细胞模型中akt表达增加，导致细胞炎症损伤明显加重[14]。同样有研究发现akt1缺失小鼠导致肾纤维化和肾小管去分化的减弱[15]。egfr是表皮生长因子受体家族成员之一。egfr在肾脏的肾小球和肾小管中广泛表达，持续且失调的egfr激活会介导进行性肾损伤[16]。且研究证实阻断egfr可以通过抑制tgf-β1信号传导和炎症以及促进减少体内尿酸积累的分子过程来减弱uan的发育[17]。stat3是一个信号转导和转录激活因子。stat3通过调节自噬相关基因水平来影响自噬的激活，研究表明抑制stat3与改善高尿酸血症和肾脏炎症有关[18]。由此可见黄柏通过多靶点、多机制治疗uan。
go功能富集分析结果表明，黄柏治疗uan的潜在靶点参与了多个生物过程与细胞组分，涉及多种分子功能。其中，在生物过程中的作用主要体现在对激素的反应、积极调节细胞迁移、正调控磷代谢过程、正向调节磷酸盐代谢过程、细胞对氮化合物的反应等过程；在细胞组分方面，受体复合物、膜筏、膜性结构域、树突、树枝状树突等多处细胞位置发挥作用；靶点基因主要通过调节磷酸转移酶活性，醇基为受体、激酶活性、蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、蛋白激酶结合等发挥生物分子功能。以此推测，黄柏可能通过调节以上方面主要发挥了对uan的治疗作用。
kegg信号通路结果显示，黄柏治疗uan主要富集在癌症途径、癌症中的蛋白聚糖、pi3k-akt信号通路、内分泌的阻力、脂质和动脉粥样硬化、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、egfr酪氨酸激酶抑制剂耐药性、age-rage信号通路在糖尿病并发症中的作用、化学致癌–受体活化、胰腺癌等路径。pi3k/akt是一种经典的信号转导通路，研究表明高尿酸通过激活pi3k/akt信号通路，从而促进促炎因子tnf-α和il-1β的释放，导致肾脏肾间质炎性损伤和肾组织纤维化，最终致使uan的发生[19]。age-rage信号通路是指由高血糖引起的蛋白质糖基化产物(ages)与其受体(rage)结合，进而引发一系列反应的一种信号传导通路。研究表明uan大鼠中rage受体会传播铁死亡诱导的肾损伤、炎症和纤维化[20]，且age (rage)受体与其配体的结合在肾脏组织中引起氧化应激和慢性炎症，最终导致肾功能丧失[21]。因此，黄柏可能通过调节多通路调节炎症反应达到对uan的治疗作用。
5. 小结
通过对于网络药理学对黄柏治疗uan的分子作用机制的预测，本研究为开展黄柏的临床应用提供了重要参考，黄柏通过抑制尿酸的合成、降低肾脏的炎症反应治疗uan，与目前研究治疗其作用机制符合，证实了黄柏通过多成分、多靶点、多通路用于治疗uan。为其临床应用提供了进一步的理论依据，但是考虑到本文仅通过检索数据库分析黄柏的药物成分来探讨其对uan的作用机制仍存在一定的局限性，之后仍需进行大量的实验和临床研究验证。
notes
*通讯作者。